Cómo entender los resultados de la citometría de flujo

Guardar

Polka Dot RF/Polka Dot/Getty Images

Los científicos usan la citometría de flujo para diferenciar distintos tipos de células u organismos microscópicos. Se trata de una herramienta que se utiliza en muchas aplicaciones como el diagnóstico médico o patología forense. Si bien esta técnica experimental es bastante fácil de lograr, el análisis de los datos complejos producidos por el citómetro de flujo es más difícil debido a los múltiples factores experimentales y/o parámetros del citómetro. Como tal, es una rutina para los datos de citometría ser visualizados y analizados utilizando programas profesionales sofisticados como CELLQuest o FlowJo. La familiaridad con las técnicas de citometría de flujo, la maquinaria y el software es necesaria para entender los resultados producidos por estos experimentos.

Comprender los datos de la citometría de flujo

Aclara el objetivo del experimento preguntando, "¿cuál era la pregunta o hipótesis investigada?". Esto es necesario para ajustar los resultados primos al formato y configuración apropiada para su posterior análisis mediante la citometría de software de estadística. Haz los cambios necesarios con el fin de tener los datos que se muestran con los ajustes pertinentes (por ejemplo, las células positivas, portales negativos, intensidad de fluorescencia, poblaciones de células, etc.).

Encuentra los portales. Las células pueden agruparse o simplemente observarse agrupadas en su densidad o diagrama de contorno. Los grupos a menudo se separan en función de su identidad. Si se agrupan manchas muy intensas de marcador o de un anticuerpo particular, se concluye que los miembros de ese grupo tienen la identidad del tipo de célula específico, lo cual expresa ese marcador. Es común encontrar células positivas para más de uno de estos marcadores, y estas células son por lo general un producto intermedio y se denota como "doble-positivo".

Fíjate en los gráficos de dispersión. La forma en que los grupos de células se reparten en un gráfico de dispersión indica el tamaño de las células. Las células con dispersión muy grande o alta por lo general son células grandes; sin embargo, pueden ser grandes simplemente debido a que contienen una alta proporción de citoplasma, o pueden ser altas debido a que tienen un gran núcleo. Dependiendo de la biología investigada, por supuesto esto variará ampliamente entre experimentos.

Observa los números. Ajusta las tramas para mostrar diferentes parámetros en un eje (normalmente el eje X), mientras mantienes los conteos en el eje Y. Esto indica la proporción de la población muestra positiva para ese parámetro en particular, ya que normalmente se observará un máximo en una muestra positivamente manchada, la cual estará ausente de la muestra control negativa.

Observa histogramas de múltiples parámetros. Ajustando el eje X y el eje Y para cada uno se representa un parámetro diferente que se investigó durante el experimento y es posible obtener una comprensión más profunda de las propiedades de la muestra. Por ejemplo, estableciendo el eje X para la fluorescencia roja y el eje Y para la fluorescencia verde, los portales estilo cuadrante pueden calcularse para la muestra para mostrar cuatro regiones de un cuadrante en las cuales están presentes las células y se tiñeron para la fluorescencia roja o verde, ambos colores, o ninguno en absoluto. Esto permite que una muestra heterogénea se divida en sus partes componentes y que se visualicen las entidades superpuestas así como se cuantifiquen.